菌落计数_创新技术(二)：滤膜与3M测试片检测
（杭州迅数科技有限公司）
滤膜与3M测试片，越来越多的应用于生物、医药、食品、环境等领域的微生物检测。很多滤膜或测试片都有一个特点，就是在其表面有着不同颜色不同大小的网格线。这些网格有助于人工观测计数，但却给目前使用越来越多的自动菌落计数仪带来困难。因为网格的颜色往往很深，导致传统的方法往往检测到网格而不是菌落。下图1、2、3分别显示了三种常用的滤膜和3M测试片，以及采用传统图像分割方法的分割结果。
其中，图1-a是塞多利斯滤膜原图，表面有黑色网格，并生长着浅黄色菌落。图1-b是采用传统的阈值分割法的分割效果。图1-c是采用彩色梯度法的分割效果。由于该滤膜的网格颜色比菌落还深，传统图像处理方法分割出来的是网格而不是菌落。
图1. 塞多利斯滤膜
图2-a是3M金黄色葡萄球菌测试片，表面有黄色网格和紫色菌落。图1-b是采用传统的阈值分割法的分割效果。图1-c是采用彩色梯度法的分割效果。这两种分割方法在分割出菌落的同时，将网格也分割出来，从而无法对菌落进行计数。
图2. 3M金黄色葡萄球菌测试片
图3-a是3M大肠杆菌测试片，表面有红色网格、红色菌落、和红色背景。这种情况是最复杂的，无论采用传统的阈值分割法（图3-b）、还是彩色梯度分割法（图3-c），都不可能得到理想的效果。
图3. 3M大肠杆菌测试片
事实证明，传统的图像处理技术，已经无法解决上述滤膜或3M测试片的菌落检测，必须研究建立新的检测方法。迅数_科技团队，历时两年的攻关，基于目前国际上先进的水平集活动轮廓模型，结合滤膜与3M测试片的特点，形成适合滤膜或3M测试片的全新分割算法，成功解决了上述问题。
1、基于形态约束的水平集活动轮廓模型
基于水平集活动轮廓模型的图像分割原理，是在极小化能量泛函的过程中，使活动轮廓不断逼近分割目标。如果在能量泛函中引入基于先验知识的约束条件，促使活动轮廓向约束条件所规定的目标逼近，就能分割出希望寻找的目标来。国际上较早提出的主要有以下两种思路。
一种是Cremers提出的基于先验知识约束的模型。设先验知识所确定的形状用水平集Ф0表示，基于形状先验知识的活动轮廓模型在能量泛函中加入一项形状约束能量项，用来引导曲线收敛于这个形状：
式中， 定义了形状先验知识发生作用的范围， 的区域被排除在积分之外。这种方法严格规定了形状信息的位置和大小，在实际应用中受到局限。
另一种是Tony Chan提出的基于形状先验知识的活动轮廓模型，该模型允许形状的平移、缩放和旋转等。如果水平集Ф2是由水平集Ф1经过平移、旋转、缩放得到的，设平移坐标为a,b，缩放倍数为r，旋转角度为θ，那么两个水平集的关系表达式为：
若ψ0是某一固定形状的水平集函数，该水平集函数通过求解符号距离函数得到。ψ是原形状通过平移、旋转或缩放后对应的水平集函数。那么基于形状先验知识的水平集模型能量函数为：
以上两种方法的数值求解，涉及对能量函数多个变量的梯度下降流求解，每次曲线迭代都需要对多个变量更新，所以活动轮廓模型的逼近速度非常慢，无法实际采用。
对网格滤膜或3M测试片而言，需要检测的菌落通常呈圆形，则水平集的形状先验知识可以设为圆形。对圆形来说，其几何变换中的平移和缩放只会导致形状变化，旋转是不会对圆形形状产生影响的，所以基于圆形的水平集模型只需要三个额外变量（a,b,r），则基于圆形约束的水平集活动轮廓模型的能量泛函可以简化为：
式中，第二项即为约束项，其作用即促使最终轮廓线收敛为一个圆形。该模型中除了需要对水平集函数求梯度下降流之外，只需要对（a,b,r）三个变量更新，迭代次数大大减轻，提高分割速度。
为实现对平皿上多个菌落的同步检测，需要进一步引入多相水平集活动轮廓模型；同时为了进一步提高检测速度，需要采用水平集活动轮廓模型的快速求解方法。而这两方面，迅数科技科的研究团队均已取得重要成果和实际应用，可以参阅“迅数科技有限公司”发表的《菌落计数_创新技术(一)：水平集活动轮廓模型》）。
2、对表面皱褶、边缘模糊菌落的检测效果
基于形态约束的水平集活动轮廓模型，既保留了水平集活动轮廓模型所具有的抗噪性强、分割边界光滑连续、可以处理表面结构复杂的情况等优点，同时又能非常好的逼近圆形目标。尤其对一些轮廓模糊、表面皱褶比较严重的菌落或细胞，展现出极其优越的分割效果。
图4显示了对一个边缘模糊的原生质体细胞的检测效果。其中，图4-a是原生质体细胞原图；图4-b采用的是一般的水平集活动轮廓模型，由于缺乏圆形约束，检测到的是一个非圆；图4-c采用的是迅数科技开发的“基于形态约束的水平集活动轮廓模型”算法，由于受到圆形约束，最后逼近的必然是个圆，从而很好的还原了细胞原态。
图4. 边缘模糊原生质体细胞的检测效果
图5显示了对一个表面皱褶十分严重的原生质体细胞的检测效果。其中，图4-a是原生质体细胞原图；图4-b采用的是一般的水平集活动轮廓模型，由于缺乏圆形约束，检测到的是一堆碎片；图4-c采用的是迅数科技开发的“基于形态约束的水平集活动轮廓模型”算法，由于受到圆形约束，最后逼近的是一个完整的原生质体细胞。
图5. 表面皱褶原生质体细胞的检测效果
3、对滤膜和3M测试片的检测效果
图6展示了采用迅数科技开发的“基于形态约束的水平集活动轮廓模型”，对网格滤膜和3M测试片的检测效果。其中，图6-a、6-b、6-c分别是塞多利斯滤膜、3M金黄色葡萄球菌测试片、3M大肠杆菌测试片的原图。图6-d、6-e、6-f是采用“基于形态约束的水平集活动轮廓模型”后的分割效果。由于具有圆形约束，活动轮廓避免了对网格的逼近，而最终检测出全部圆形菌落。
图6. 基于形态约束的水平集活动轮廓模型效果
4、展望
基于水平集活动轮廓模型的图像分割方法，具有抗噪性强、数值求解稳定性好、分割边界光滑连续、可以处理拓扑结构复杂的情况等优点，成为目前国际上前沿的图像分割技术之一。
迅数科技研发团队，历经两年多的攻关，不仅掌握了这一先进技术，而且针对微生物菌落的特点，在传统的水平集活动轮廓模型的基础上，创造性的研究开发出适合复杂菌落分割计数的快速活动轮廓模型、多相水平集活动轮廓模型、以及基于形态约束的水平集活动轮廓模型。这些模型不仅实现了复杂菌落、高难度平皿的准确有效统计，而且也适用于细胞等的检测。 |
